El objetivo de la PCR fue determinar la prevalencia de la mutación 185delAG.
Extracción de DNA de sangre periférica
Análisis de la mutación 185delAG: Para detectar la mutación 185delAG se utilizó la técnica de un mismatch PCRque es un método para la detección de una mutación puntual que no produce ni destruye un sitio de restricción; utiliza primers o cebadores para complementar la secuencia del ADN. El ADN amplificado mutante (a diferencia de la amplificación de ADN normal), cuando se digiere con endonucleasas apropiadas, electroforesis y se sondeó con un oligonucleótido marcado apropiado, revela un nuevo fragmento, menor restricción. Alternativamente, los primers o cebadores de PCR mismatch pueden ser diseñados para crear un nuevo sitio de restricción con el ADN normal, pero no con el ADN mutante.La técnica usada genera dos bandas de 150pb y de 20pb para el alelo normal y solo una de 170pb para el alelo mutado, pues la enzima de restricción no corta el producto amplificado si esta presente la mutación.
La confirmación de la mutación 185delAG fue realizada por:
1. Amplificación por PCR del Exon 2 del Gen BRCA1 y Electroforesis en geles denaturantes de acrilamida-bisacrilamida
2. Hibridación alelo específica: consiste en los siguientes pasos:
- Transferencia del DNA a soporte sólido mediante la técnica de Dot Blotting
- Marcación del oligonucleótido en el extremo 3'OH con digoxigenina-11-dd UTP
- Hibridación de filtros con el oligonucleótido marcado con digoxigenina-11-dd UTP
- Detección de la hibridación mediante quimioluminicencia
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